宫颈癌HPV疫苗的研究

　　世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位；每年全球大约有50 万例新发宫颈癌病例，约20万人死于宫颈癌，其中，80％的死亡发生在发展中国家。据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有 5万人死于宫颈癌。大量研究资料证明，生殖道的hpv(人rutoy瘤病毒) 感染与宫颈癌有着十分密切的关系———约80％的宫颈癌与4种类型(16、18、31型和45型)的hpv 感染有关。其中，50％的宫颈癌与hpv16感染相关。目前，临床上尚无预防hpv16感染的措施，而且对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果也不理想。宫颈癌的复发率较高且治疗费用也高。在美国，每年用于宫颈癌筛查和治疗的费用约为5.7亿美元。因此，研制高效、廉价的hpv疫苗，采用特异性的免疫接种方法预防和治疗hpv感染及其所引起的恶性病变，对预防和治疗宫颈癌有着十分重要的意义。

　　日前，在北京召开的“第一届全国现代免疫诊断技术学术研讨会” 上，中国疾病预防与控制中心病毒所田厚文主任，介绍了hpv疫苗在防治宫颈癌中的作用和国内外hpv疫苗研究的最新进展。

　　hpv疫苗可引发机体的强烈免疫反应

　　田厚文主任介绍说，一般认为，hpv最先感染表皮基底层细胞，并随着基质干细胞向表皮细胞的分化，依次进行早期蛋白的表达、dna复制和晚期蛋白的表达及病毒颗粒的装配。hpv基因组dna在宫颈癌细胞中大多以整合状态存在，并在转化蛋白e6和e7中大量表达，当病毒dna整合后，就不再有病毒颗粒的产生。大量的临床研究和实验室资料表明， hpv宿主的免疫反应，对控制其hpv感染及相关病变具有十分重要的作用。大多数hpv感染者都可以自发清除其感染的hpv，而不会出现任何继发病症，只有持续性hpv感染才与宫颈病变密切相关。对已感染了hpv病毒并已引起相应疾病的个体，细胞免疫比体液免疫更为重要。同时有研究发现，感染了hpv的cin(zg颈上皮内肿瘤)和宫颈癌患者体内，普遍存在对hpv的低免疫状态。因此，有可能使用疫苗，特别是联合免疫疫苗来刺激患者的机体产生强有力的免疫反应。这种联合免疫能诱发机体产生针对hpv早期蛋白(e6和e7转化蛋白)的细胞毒性淋巴细胞反应，从而将含有整合dna的细胞或癌细胞杀伤，同时控制早期hpv感染的病毒增殖。它还能诱发机体产生中和抗体，以中和病毒，减少病毒感染细胞数，并帮助ctl(肿瘤特异性杀伤t淋巴细胞)更好地清除病毒感染。这种中和抗体主要由具有天然空间结构的病毒壳蛋白(hpv晚期蛋白)诱发。上述两类免疫反应建立后，就能有效地清除已有的hpv 感染和手术后残余的癌细胞，以及预防hpv的再次感染，达到预防和治疗宫颈癌的目的。

　　hpv疫苗分防、治两类，其作用也有交叉

　　田主任说，由于hpv在体外难以培养和具有致癌性，因此不大可能将完整的hpv的病毒颗粒制成疫苗，只能研制基因工程疫苗。近十几年来，hpv疫苗研究可以分为两类，即预防性疫苗研究和治疗性疫苗研究。预防性疫苗一般以hpv16主要衣壳蛋白l1和次要衣壳蛋白l2为靶抗原，其作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应，以阻止hpv的长期感染和再感染。hpv的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒(vlp)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似。vlp能与细胞受体结合并进入细胞，这样有利于抗原的加工呈递以及诱发较强的细胞免疫。治疗性疫苗通常是以经修饰后去除其转化活性，但仍保留其抗原性的hpv1 6早期蛋白作为靶抗原，它可诱导特异性的细胞免疫反应，被用于控制或消除感染hpv的良性和恶性病灶，并可作为这类疾病的手术后的辅助治疗。在大多数与 hpv16相关的宫颈癌及其癌前病变中，hpv16的e6和e7蛋白持续表达，而这种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的。并且，正常组织中不存在这两种蛋白。因此，e6和e7蛋白就成为hpv16相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。对中晚期宫颈癌病人手术后残留的肿瘤细胞，可应用这种治疗性疫苗———通过激发病人的细胞免疫来杀伤、清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或限制肿瘤的复发和扩散。预防性和治疗性hpv疫苗的作用也有交叉，如在良性疣和轻度cin病变中存在hpv晚期蛋白的表达，预防性疫苗对这些疾病也有一定治疗作用。近年研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、hpv假病毒疫苗等，同时具备预防和治疗双重作用。

　　多个hpv16候选疫苗已进入ⅰ／ⅱ期临床试验

　　田主任接着介绍了目前国际上已进入ⅰ／ⅱ期临床试验的几种hpv16 候选疫苗的有关情况。

　　病毒样颗粒疫苗研制hpv预防性疫苗常用的靶抗原，是hpv的主要衣壳蛋白l1蛋白和次要衣壳蛋白l2 。近十年来，人们研究较多的是利用昆虫细胞、重组痘苗病毒以及沙门氏菌和大肠杆菌等的表达系统，来表达 l1蛋白和 l2蛋白。因l1和l2表达蛋白可自我装配或经体外包装折叠形成病毒样颗粒，其有着与天然病毒颗粒十分相似的空间结构和抗原表位，且不含hpvdna，所以，病毒样颗粒疫苗被认为是有前途的宫颈癌预防性疫苗。人们在多种动物模型实验中都观察到，经病毒样颗粒免疫后，动物体内可产生高滴度的血清中和抗体，能保护动物免受hpv的实验性攻击。而且，这种保护作用可随着动物的血清传递。目前，人们对以昆虫细胞表达的hpv16型l1病毒样颗粒疫苗进行的ⅰ／ ⅱ期临床试验已经完成。试验结果显示，用病毒样颗粒疫苗以肌肉注射途径进行免疫，受试者中未见明显毒性反应，其体内有较高滴度的中和抗体产生，其滴度比自然感染高约40倍。这种hpv16病毒样颗粒疫苗ⅲ／ⅳ期临床试验的前瞻性研究，已在爱沙尼亚和北欧国家完成，其大规模的ⅲ／ⅳ期临床观察正在筹划之中。

　　为了研制既有预防效果，又有治疗功能的hpv疫苗，最近几年国际上已研究出几种由l1衣壳蛋白和e7多肽组成的e7嵌合病毒样颗粒。这些嵌合病毒样颗粒除能使机体产生中和抗体外，还能诱导机体产生较强的 e7特异性c tl反应和抗肿瘤活性，被认为是最有前景的宫颈癌预防、治疗性疫苗。这种疫苗有望用于治疗已有hpv16感染的、有或没有临床症状的病人。目前，一种包括hpv16型l1、l2和e7靶抗原的嵌合病毒颗粒疫苗(以昆虫细胞表达) ，将要进入ⅰ期临床试验。然而，由于以昆虫细胞表达纯化的病毒样颗粒疫苗成本很高，受经济条件限制，这种疫苗在发展中国家或落后地区不可能被广泛应用。因此，必须寻找其它高效、廉价的肿瘤疫苗。

　　痘苗病毒载体疫苗曾用于消灭人类天花的痘苗病毒是最为常用的病毒载体，其具有长期、大规模的人类接种史。同时，痘苗病毒感染率高，外源基因表达水平高，又为裂解性病毒，其基因组与宿主细胞基因组整合的几率非常小，因而无致癌性担忧。这些特性使痘苗病毒成为肿瘤疫苗的合适载体。但痘苗病毒载体疫苗也存在着不足，其产生的并发症一 直阻碍着它的广泛使用。此外，接种该疫苗后产生的抗痘苗病毒抗体可能抑制再次免疫，从而影响了它的免疫治疗效果。重组痘苗病毒疫苗多为活性重组疫苗，具有用量少、抗原不需纯化等优点。用其免疫接种后，重组病毒在体内产生大量抗原，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。同时，病毒载体本身还可发挥佐剂效果。1996年，英国用表达hpv16型和 hpv18型的e6和e7蛋白以及重组痘苗病毒疫苗进行了宫颈癌治疗的一期临床试验，没有发现明显的副作用，在部分受试病人体内可检测到特异性抗体和ctl反应以及细胞因子，其在不同个体中的反应各不相同—— —这主要与癌症病期有关。近年来研制成功的非复制型痘苗病毒载体，除具有痘苗病毒载体的一般优点外，还具有在人体中不能繁殖后代，却 能有效表达外源基因的优点，从而大大减少了免疫缺损病人在“种痘” 后出现并发症的可能性，使该疫苗用于人体更为安全。由于其免疫效果不像活痘苗那样依赖于病毒能否繁殖，因此有可能在一定程度上克服痘苗病毒载体疫苗存在的再次免疫效果不好的问题。用非复制型痘苗病毒载体构建的狂犬疫苗和hiv疫苗在国外也已进入人体试验阶段。我国在 “九五” 期间用非复制型痘苗病毒天坛株载体，成功研制了hpv16非复制型痘苗病毒疫苗。该疫苗在动物实验中被证实具有特异性ctl反应和抗肿瘤移植反应。最近，我国有研究者将hpv16治疗性重组痘苗病毒疫苗与蛋白疫苗联合使用，获得了理想的免疫效果。

　　多肽疫苗在许多抗原研究中，由ctl识别的抗原决定簇被确定，这为开发多肽疫苗提供了可能。hpv16 型e6、e7多肽在宫颈癌细胞中持续存在，被认为是重要的恶性转化因素。因此，用hpv16型e6或e7多肽免疫，有可能加强肿瘤特异性ctl的产生。目前，人们已经发现了hpv16型 e6、e7抗原中的几个能与人hla-aⅱ 相配的ctl表位。用hpv型e7多肽疫苗免疫hpv相关肿瘤这一方法，也已进入ⅰ／ⅱ期临床试验，试验中未见其有明显副作用。由于多肽疫苗具有易于生产、价廉等优点，因此，多肽疫苗有一定的应用前景。但多肽疫苗由于受mhc- ⅰ类分子的限制性影响，对于不同遗传背景的个体需要使用与接种对象的hla相匹配的多肽疫苗。但目前除与人hla -aⅱ相配的ctl表位外，人们对hpv16型e6、 e7抗原中与其它类型mhc-ⅰ类分子相结合的ctl表位尚未明了，因此使得多肽疫苗的应用受到较大限制。此外，合成肽疫苗的不足之处还在于其免疫源性不强，大多需要辅以强佐剂才能获得有效免疫反应，这也影响了该疫苗的实际应用。

　　dna疫苗dna疫苗是将抵入目的基因的表达质粒导入人体内，通过在人体内表达抗原而引起人体的特异性免疫反应。与其它疫苗相比，dna 疫苗有许多优点，其中包括可以激发细胞免疫和体液免疫、易于构建和改造、易于制成多价疫苗、不需要佐剂、热稳定性好、成本低廉等。目前，用于研制hpv治疗性dna疫苗的基因多为hpv16型e 7基因。为了获得更好的免疫效果，可将e7基因进行一些修饰，从而增强mhc-ⅱ类抗原的呈递，提高细胞介导的免疫应答。动物实验证明，用sig／e7／lamp1 融合基因制备的dna疫苗，比采用野生型e7基因制备的dna疫苗有更好的抗肿瘤效果。这一经肌肉注射途径免疫的疫苗，其ⅰ／ⅱ期临床试验目前正在约翰霍普金斯医院进行。值得指出的是，dna疫苗在人体中免疫效果弱的问题及安全性问题尚待进一步解决。

　　我国hpv疫苗的研制已与国际接轨

　　田厚文主任最后介绍了我国在hpv研究方面的成果。他说，我国在 “九五”期间已将hpv疫苗的研制及应用作为重点攻关课题。经过近5年的研究，我国在hpv疫苗的研制方面已经与国际接轨。在借鉴国外成功经验的同时，我国在这方面的研究也取得了具有自身特色的研究成果。 “九五”期间，在hpv16预防性疫苗的研制方面，我国完成了 hpv16型l1 和l1／l2重组杆状病毒疫苗株的构建，并在昆虫细胞中进行了表达；在电镜下观察到病毒样颗粒的形成；成功地构建了l1／l2均表达的重组复制型和非复制型痘苗病毒疫苗株。在hpv16治疗性疫苗的研制方面，我 国已构建了表达hpv16型e6／e7蛋白的重组复制型和非复制型痘苗病毒疫苗株。经测试，这些疫苗株具有良好的免疫原性，可诱发特异性的ctl 反应，能够保护c57小鼠抵抗tc-1肿瘤细胞的攻击。与对照组相比，接种这种疫苗后，小鼠皮下成瘤时间延迟，荷瘤小鼠生存期明显延长。研究人员用这种hpv治疗性疫苗对肿瘤术后小鼠进行免疫治疗时发现，这种疫苗能有效预防小鼠的肿瘤复发，说明该疫苗可作为hpv16相关肿瘤及癌前病变的免疫治疗候选疫苗。尤其是该疫苗在杀伤肿瘤手术后残余的或已转移的肿瘤细胞上，以及在防止肿瘤转移上具有一定的应用价值。这些研究成果为我国研制基因工程hpv疫苗奠定了基础。